非特異染色的原因包括一抗和二抗與(yu) 血清蛋白的相互作用，抗體(ti) 與(yu) 組織之間的離子相互作用，以及與(yu) 能夠影響IHC檢測係統的內(nei) 源分子的相互作用。這些問題會(hui) 產(chan) 生高背景，以及無法在適當的位置觀察目的抗原。這種類型的染色問題可通過用封閉劑來封閉非特異相互作用來解決(jue) 。在將樣本與(yu) 一抗共同孵育之前，可開展這些步驟

預防非特異疏水相互作用

盡管疏水相互作用在抗原表位-抗體(ti) 的結合中起了重要作用，但這些力同樣能促進非特異結合。由於(yu) 一些氨基酸的中性側(ce) 鏈，大部分蛋白有著某種程度的疏水性。將組織與(yu) 熱滅活的正常血清或牛血清白蛋白（BSA）共同孵育，是降低非特異疏水結合的常用步驟。正常血清類型的選擇對預防與(yu) 一抗或二抗的相互作用，或預防與(yu) 待染色組織/的相互作用很重要。例如，在使用山羊來源的一抗時，不建議用山羊血清作為(wei) 封閉劑。而是推薦與(yu) 二抗的宿主動物相同的血清或來自不相關(guan) 物種的血清。BSA和脫脂奶粉常用作封閉劑。這些試劑通常包含在一抗和二抗的稀釋液中。非離子去汙劑如0.3% Triton X-100?或Tween 20?的添加也能降低非特異疏水相互作用。

預防非特異離子相互作用

如果使用的抗體(ti) 與(yu) 目的組織有著相反的淨電荷，那麽(me) 離子相互作用可能導致非特異的背景染色。例如，非特異染色可能來自相反的羧基和氨基相互作用。範德華力、兩(liang) 級分子間的弱靜電相互作用也能起作用。增加固定劑和/或抗體(ti) 稀釋液的離子強度能降低離子相互作用。不過，表位-抗體(ti) 結合通常依賴於(yu) 離子強度，因此這種方法也可能負麵影響染色特異性。由於(yu) 單克隆抗體(ti) 的單表位特異性，與(yu) 多克隆抗體(ti) 相比，增加離子強度更可能損害其性能。

內(nei) 源酶的幹擾

顯色檢測法常使用一種結合的酶來觀察表位-抗體(ti) 的相互作用。在使用這種檢測方法時，同一種酶的內(nei) 源活性必須被封閉。例如，包含辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）的操作步驟可能需要試劑來防止非特異信號。腎、肝或帶有紅的血管區域等組織含有內(nei) 源的過氧化物酶活性。由3-10% H2O2配製而成的過氧化物酶封閉液能用於(yu) 防止內(nei) 源的過氧化物酶切割底物。