幾種酵母轉化方法

酵母轉化原理：
像釀酒酵母,線性化的轉化DNA和Pichiapastoris基因組的同源區域發生同源重組,使得線性化DNA產(chan) 生穩定的轉化子（Cregg et al., 1985; Cregg etal.,1989）.這樣的整合方式顯示*的穩定性,即使多拷貝轉化子在沒有選擇壓力的情況下也很穩定.單交換事件（插入）比雙交換事件（置換）發生幾率更大.單插入事件中約發生1-10%概率的多插入事件.

電轉化注意點：
一、  製備感受態的菌液收集時間：
1、準確測定OD值：OD在1.2～1.5之間。
1） 為(wei) 了準確測定OD值，建議將菌液稀釋不同濃度測定（1、2、4、8、16倍稀釋，看其OD值是否呈線性關(guan) 係）。每個(ge) 倍數做3－5個(ge) 重複，應該可以大致推斷OD值是否準確！菌液看上去渾濁，但OD值不高，很可能OD稀釋倍數不夠！
2） OD值是否測準也可以這樣估算：OD600為(wei) 40左右時，菌體(ti) 濕重（6000rpm離心5min）約0.95g/10ml。高密度發酵時菌體(ti) 濕重將相應下降。
2、75ml的菌，經18h左右的培養(yang) ，zui後sorbital洗滌完畢後，50ml離心管裏所剩菌體(ti) 特別濃，需要1mlsorbitol才可溶解為(wei) 糊狀。正常培養(yang) 的OD在1.2～1.5之間的500ml菌液，收集的感受態也用1ml稀釋的，沒那麽(me) 粘稠。可以看看降低培養(yang) 溫度（27攝氏度）或縮短培養(yang) 時間（12h）。
   3、甚至不用轉接,直接挑單克隆在50－100mlYPD中搖過夜，效果也很好

二、製備感受態的菌液量
如果隻轉一個(ge) 樣品，50ml就夠了，一般50ml的培養(yang) 液如果OD值正常的話夠做10管感受態的，其他的按比例縮小。用大試管搖5ml菌液，然後取1ml毫升在1.5mlEP管中製感受態，每一步的離心時間30秒就行。整個(ge) 流程時間短，製備好的感受態用來做轉化的效率很高。
山梨醇離心，洗滌的過程之後的重懸的時候注意濃度，不要過於(yu) 粘稠和稀釋。

三、感受態的保存
感受態細胞做好後由於(yu) 電轉化杯還沒有處理好等原因，在冰上放幾個(ge) 小時再做可能有一定的影響，盡量馬上製備馬上轉化。如果感受態細胞要保存，不需要加甘油，一般80ul EP管分裝，-70 或 -80 攝氏度保存。

另附：酵母GS115點種分離純化
接種GS115於(yu) 5ml YPD液體(ti) 培養(yang) 基，30℃，200rpm振蕩過夜，塗布 YPD平板，30℃培養(yang) 48 小時，用 YNB基本培養(yang) 基和含His的補充培養(yang) 基作點種分離純化，挑選在補充培養(yang) 基生上生長而在基本培養(yang) 基上不生長的單菌落劃YPD平板，4℃保存。

四、電轉化注意點：
1、感受態做好後，zui後一次吸出sorbital時，不是直接倒調的，而是用毛細管輕吸出來的，這樣可能使剩下的感受態純淨些。
    2、zui後用毛細管取出100ul出來，加入質粒，混勻！（怕量不夠，吸得很多，電轉時效果反而不好。 ）
3、電轉杯清潔處理:一般先衝(chong) 洗，洗淨；然後浸泡在75%的乙醇中；使用前我們(men) 都是放在超淨台上，開啟紫外，邊吹風晾幹，邊進行紫外照射。電轉杯的新包裝或重複使用可能對轉化率有一定的影響。
4、電擊的時候，電壓數以及電擊時間可以摸索一下，適當增加電壓或者延長電擊時間都可以。電擊條件比如1.5kv，放電4.8～5.5ms。電擊所有過程都要盡量在冰上進行，電擊時間可以減少一點，設置為(wei) 5ms左右，電擊之後馬上加入預冷的山梨醇溶液，轉移至EP管，30度靜止培養(yang) 1h。如果菌體(ti) 懸液濃度比較大的時候，在製備感受態的時候要留心一下操作中的問題了。
    5、電擊之後，加入1ml的山梨醇，吸入1.5ml的ep管中，置於(yu) 30度搖床低速培養(yang) 1h，再塗板。
    6、注意的是處理液中的DTT是在使用前加入，其它配好後於(yu) 4度保存，DTT單獨於(yu) -20度保存，可配成100倍的貯備液。
7、轉化後1ml用sorbitol重懸的細胞懸液不能全部塗在一塊板子上，按標準程序製作的感受態一般3塊左右可能比較合適，以幹燥後看見一薄層淡淡的白色為(wei) 宜。轉化子會(hui) 在白色的薄層上長出圓韻、飽滿的大菌落的。

五、轉化試劑和培養(yang) 基的正確準備方法
1、MD板子提前幾天做好，放在冰箱裏，塗板的時候吸收效果會(hui) 好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些積層，反而不利於(yu) 生長。
    2、YNB42度水浴一會(hui) ，然後過濾除菌，YNB是加到培養(yang) 基裏麵的，去離子水pH偏低，建議直接用蒸餾水就可以（關(guan) 係不是太大）。
3、山梨醇，以及無菌去離子水均是冰凍，存放在4度冰箱中
4、一般用10ug以上質粒用SalI酶切，然後直接加乙醇沉澱，70％乙醇洗一遍，約20ulddH2O重溶。轉化效率一般大於(yu) 100個(ge) 克隆每ugDNA。有人用LiCl和DTT處理細胞，轉化效率很高，可以試試。建議你不要用膠回收kit，回收的DNA可能還有鹽，導致電擊時放電時間很短。

5個(ge) 電轉化方案
方法一：
1.收集菌體(ti)
取1mlGS115過夜培養(yang) 物（OD約6-10） 分裝到1.5ml EP管中，4℃、10000g 離心1min，棄上清，沉澱用無菌水（4℃）洗滌，同樣條件下離心，棄上清。
2.菌體(ti) 處理
加入1ml處理液，室溫下放置20min。
處理液：
10mM LiAc
10mM DTT
0.6M sorbitol
10mM TrisHCl（pH7.5）
3.離心，棄上清，加入1ml 1M sorbitol ，離心，棄上清，
4.用1M sorbitol洗滌二次，到zui終體(ti) 積約為(wei) 80μl.（菌體(ti) 太多可適當棄去部分）
5.加入10μl.經過BglⅡ酶切處理的工程質粒，混勻後轉入 電擊杯中，冰浴5min.
6.電轉. 1.5kv，25μF，200Ω條件下進行電轉。
7.電擊後立刻加入1mL 1M sorbitol，吸出後於(yu) 30℃培養(yang) 2h。
8.取一定量塗平板（YPDS + Zeocin，塗布的量分別為(wei) 100、200微升，剩餘(yu) 的經離心處理後全部塗在一個(ge) 平板上）

有一點要注意的是處理液中的DTT是在使用前加入，其它配好後於(yu) 4度保存，DTT單獨於(yu) -20度保存，可配成100倍的貯備液。

方法二：按下麵步驟轉化,開始每個(ge) 板子隻長了一二十菌落;小細節修改後,每個(ge) 板長了約100個(ge) .
步驟如下：
1、目的DNA（pPIC9K），經電泳檢測已經線性化（SalI酶切）；
2、DNA純化方法是經酚仿－氯仿兩(liang) 步抽提後，無水乙醇沉澱的，目測定量應足夠；
3、GS115甘油菌經新鮮平板複蘇後，5ML培養(yang) 過夜，16h左右後，取菌1：100稀釋，接種於(yu) 70ml菌液擴大培養(yang) ，14h後測得OD600約1.3左右。
4、將sorbital、水和菌液均冰浴；
5、菌液離心5min－100ml冰水洗滌－50ml冰水洗滌－4ml sorbital洗滌，然後溶解於(yu) 300ul冰sorbital；
6、加入約5～10ug的DNA，槍吹勻，置0.2CM電轉杯靜置5min；
7、電擊，1,5KV.
8、立即加入1ml冰浴的sorbital，靜止10min。
9、取100ul轉化液，塗布10cm的MD平板。
做了一點修改每塊板子大概能長100來個(ge) 菌落（一般需要2天左右）：
1、菌液收集時間：以前可能是OD值測得不太準確，我然後把菌液分別做了1、2、4、8、16倍稀釋，看其OD值是否呈線性關(guan) 係。1、菌液測OD值時，建議將菌液稀釋不同濃度測定，這樣才準確些。菌液看上去渾濁，但OD值不高，很可能就是你的OD稀釋倍數不夠！你分別稀釋2倍、4倍、8倍、10倍等，每個(ge) 倍數做3－5個(ge) 重複，應該可以大致推斷OD值是否準確！
2、我開始是先挑單克隆於(yu) 5mlYPD中，過夜16h後，轉接於(yu) 50mlYPD中，培養(yang) 大概18個(ge) 小時吧。OD值是否測準可以這樣估算：OD600為(wei) 40左右時，菌體(ti) 濕重（6000rpm離心5min）約0.95g/10ml。高密度發酵時菌體(ti) 濕重將相應下降。[測OD，用什麽(me) 作空白對照呢？菌體(ti) 稀釋液，我一般使用PBS]
3、電擊條件等上麵帖子上都有，1.5kv，放電4.8～5.5ms。
2、其它做法相同，就是感受態做好後，zui後一次吸出sorbital時，不是直接倒調的，而是用毛細管輕吸出來的，這樣可能使剩下的感受態純淨些。
3、zui後用毛細管取出100ul出來，加入質粒，混勻！（我以前怕量不夠，吸得很多，電轉時效果反而不好。 ）
4、MD板子提前幾天做好，放在冰箱裏，塗板的時候吸收效果會(hui) 好些。如果是新板子，可能吸收不是太好，板子上有些積層，反而不利於(yu) 生長。
5、你說的YNB，我用的是成品，隻需要直接配製。42度水浴一會(hui) ，然後過濾除菌。我沒有加硫酸銨。YNB是加到培養(yang) 基裏麵的，去離子水pH偏低哦，我建議直接用蒸餾水就可以了（關(guan) 係不是太大）。

方法三：簡便*
在篩選高表達菌種中，與(yu) 大多數人和說明書(shu) 有區別（成功做出幾個(ge) 基因）:
每次轉化前，均用多種酶BlgII/salI/sacI同時切，轉化時，用GS115/KM71/KM71H同時轉化，轉化的條件也和大家一樣，即1.5/25/200,但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，轉化後塗MM及YPD+0.25G，長出菌落後，即進行大規模的表達試驗，直接用YPD表達的，一般48h後即進行大量的SDS-PAGE鑒定，鑒定時，樣品不用濃縮，直接上樣，看到目的帶後再做PCR，測序。

方法四：沒有轉化子（無aa的YNB和硫酸銨稱好後，去離子水溶解，然後高壓滅菌）
1.挑取酵母單菌落，接種至含有50ml YPD培養(yang) 基的三角瓶中，30℃、250-300rpm培養(yang) 過夜約14h，OD600約1.3
2.菌液離心5min－50ml冰水洗滌－25ml冰水洗滌－2ml sorbital洗滌，然後溶解於(yu) 200ul冰sorbital；兩(liang) 管分裝，每管100ul
3.加入約5～10ug的線性化的DNA20ul，槍吹勻，置0.2CM電轉杯冰浴5min；
4.電擊，1,5KV.使用的是 Eppendorf 2510，用於(yu) 轉化細菌及酵母。
5.立即加入1ml冰浴的sorbital，靜止1h。
將菌體(ti) 懸液塗布於(yu) MD平板上，每300µl塗布一塊平板；

方法五: 和說明書(shu) 差不多的方法
X33菌株於(yu) 100ml YPD搖到OD600約1.1-1.3，太高影響感受態效率
（1）  1500－1700g離心5min，將離心管倒置在吸水紙上輕輕控幾下，充分棄上清
（2） 加入100ml 冰浴的超純水ddH2O，可在振蕩器上振蕩混勻，可靜置3－5分鍾
（3） 離心，棄上清，再加100ml ddH2O洗一遍
（4） 離心，棄上清，加20ml 冰浴1M Sorbitol洗一遍
（5） 離心，棄上清，菌體(ti) 置於(yu) 冰浴中，加入約100－200ul Sorbitol混勻
加入Sorbitol量需自己調整，這時菌液很濃，隻要能夠用200ul黃槍頭吸出來就可以了，一般共有約400－500ul，夠做幾管感受態了。
（7） 吸取100－150ul感受態到線性化的DNA中，用槍頭打勻或手指彈勻
靜置5min，於(yu) 2mm電轉化杯中，電擊參數：1.5KV，25uF，200歐姆（不是400），一般放電時間在4.5-4.9ms之間，小於(yu) 4說明你的DNA鹽濃度太高
（9） 立即加入1ml Sorbitol，轉入10ml 離心管，30度靜置1小時，然後加入1ml YPD，30度，200rpm搖1小時，取50－200ul菌液塗100ul/ml YPDS板
（10） 一般轉化效率可以達到：200個(ge) 以上轉化子每200ul菌液，足夠篩選表達菌株了。

方法六:酵母感受態細胞的製備
⑴ 接種Pichia pastoris GS115於(yu) 5 ml YPD液體(ti) 培養(yang) 基，30℃，250~300250 rpm ，過夜。
⑵ 取200µl的培養(yang) 物接種至含有500ml新鮮培養(yang) 基的三角搖瓶中，28~30℃、250~300r/min培養(yang) 過夜，一般12小時左右。
⑶  將細胞培養(yang) 物於(yu) 4℃，5000g離心5min，用500ml的冰預冷的無菌水將菌體(ti) 沉澱重懸；
⑷  按步驟3離心，用250ml的冰預冷的無菌水將菌體(ti) 沉澱重懸；
⑸  按步驟3離心，用20ml的冰預冷的1M的山梨醇溶液將菌體(ti) 沉澱重懸；
⑹  按步驟3離心，用1ml的冰預冷的1M的山梨醇溶液將菌體(ti) 沉澱重懸，其終體(ti) 積約為(wei) 2ml；
⑺  NOTE：可將其分裝為(wei) 200µl一份的包裝冷凍起來，但如果保存時間過長會(hui) 影響其轉化效率。

化學轉化

畢氏酵母氯化鋰轉化法
試劑
1. 1M LiCl：用去離子蒸餾水配製，濾膜過濾除菌；必要時用消毒去離子水稀釋
2. 50% PEG3350 ：Sigma P3640 用去離子蒸餾水配製，濾膜過濾除菌，用較緊的蓋子的瓶子分裝
3. 2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存
注：醋酸鋰對畢氏酵母無效，僅(jin) 氯化鋰有效；PEG3350可屏蔽高濃度LiCl的毒害作用；

畢氏酵母的轉化
1. 煮沸1ml鮭魚精DNA 5min，迅速冰浴以製備單鏈擔體(ti) DNA；
2. 將感受態酵母菌離心，以Tips去除殘餘(yu) 的LiCl溶液；
3. 對於(yu) 每一個(ge) 轉化，按以下順序加入：
50% PEG3350 240ul
1M LiCl 36ul
2mg/ml 單鏈Salmon sperm DNA 25ul
5～10ug/50ul H2O 質粒DNA 50ul
4. 劇烈旋渦混勻直至沉澱菌體(ti) *分布均勻（約1min）；
5. 30℃水浴孵育30min；
6. 42℃水浴熱休克20～25min;
7. 6000～8000rpm離心收集酵母菌體(ti) ；
8. 重懸酵母於(yu) 1ml YPD培養(yang) 基，30℃搖床孵育；
9. 1～4h後，取25～100ul菌液鋪選擇性培養(yang) 基平板，於(yu) 30℃培養(yang) 2～3天鑒定（將表達菌株和對照菌株在固體(ti) 培養(yang) 基平板，30'c培養(yang) 至轉化子出現） 

畢氏酵母PEG1000轉化法

試劑
緩衝(chong) 液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol
緩衝(chong) 液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35
緩衝(chong) 液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35
未汙染的新鮮、試劑級DMSO，-70℃保存
注：1. 緩衝(chong) 液A、B、C均用濾膜過濾，-20℃保存;
2. 將DNA直接加在凍結的酵母細胞上是本實驗的關(guan) 鍵之處（即使在冰上解凍的待轉化細胞，其攝取外源DNA的能力也在解凍過程中迅速下降；如進行多樣品的轉化，建議按6樣品/組進行）;

待轉化畢氏酵母的製備
1. 接種環接種Pachia pastoris於(yu) YPD平板，30℃培養(yang) 2d;
2. 挑取單克隆酵母菌株於(yu) 10mlYPD培養(yang) 基中，30℃振蕩培養(yang) 過夜；
3. 取步驟2中小量菌液接種到100mlYPD培養(yang) 基中振蕩培養(yang) ，待其OD值從(cong) 0.1升到0.5～0.8；
4. 室溫下3000g離心收集酵母菌體(ti) ，50ml緩衝(chong) 液A洗滌一次；
5. 重懸菌體(ti) 於(yu) 4ml緩衝(chong) 液A中，按0.2ml/管分裝於(yu) 1.5ml的離心管中，每管加入11ulDMSO，混合後迅速於(yu) 液氮中冷凍，
6. -70℃保存

畢氏酵母的轉化
1. 將約50ug線性化質粒DNA溶於(yu) 20ul TE或水中，直接加於(yu) 凍結的酵母細胞中；加入擔體(ti) DNA（40ug變性超聲線性化鮭魚精DNA）以獲得zui大轉化率；
2. 37℃水浴孵育5min，中間混合樣品1～2次；
3. 取出離心管，加入1.5ml緩衝(chong) 液B，*混勻；
4. 30℃水浴孵育1h；
5. 室溫下2000g離心10min，去除上清液，菌體(ti) 沉澱重懸於(yu) 1.5ml緩衝(chong) 液C中；
6. 離心樣品，去除上清液，輕微操作將樣品重懸於(yu) 0.2ml緩衝(chong) 液C中；
7. 將所有轉化液鋪於(yu) 選擇性平板，於(yu) 30℃孵育3～4天後，鑒定；

畢赤酵母轉化方法有4 種。zui常用的是電轉化法和原生質體(ti) 法,其中電轉化法zui為(wei) 方便,轉化效率zui高,zui容易產(chan) 生多拷貝整合。由於(yu) 原生質體(ti) 法必須首先製備去除細胞壁的原生質體(ti) 細胞以利於(yu) DNA 進入,然後細胞再生細胞壁,產(chan) 生轉化體(ti) ,而ZeocinR 抑製細胞壁的形成,導致不能產(chan) 生轉化體(ti) 。因此利用ZeocinR作為(wei) 選擇標記的載體(ti) 如p PICZ 係列,不能使用原生質體(ti) 法進行轉化