免疫電鏡集電子顯微技術與(yu) 免疫細胞化學技術於(yu) 一體(ti) ，能顯示抗原或在細胞超微結構水平的位置，已成為(wei) 當今生物醫學領域的一項重要研究手段。由於(yu) 免疫電鏡製作過程長，操作程序煩鎖，因此，要得到滿意的免疫金染色切片，必須在關(guan) 鍵環節上給予注意，以下我們(men) 就免疫電鏡染色技術中的幾個(ge) 問題進行探討。

1、染色標本的固定
    理想的免疫電鏡標本固定既要保存組織的抗原，又要具有良好的細胞超微結構。對於(yu) 多數抗原，按常規電鏡技術固定標本會(hui) 使其抗原性部分或*消失，因此，免疫電鏡常用一些特殊的固定液，如過碘酸鹽-賴氨酸-多聚甲醛固定液(PLP)、4%多聚甲醛固定液、多聚甲醛加低濃度的戊二醛固定液( PG)（相關(guan) 試劑：戊二醛 25%溶液）及苦味酸-多聚甲醛固定液。我們(men) 在實際工作中發現，用1%多聚甲醛加0.01% -0.05%的戊二醛。此固定液不但配置簡單，而且效果滿意。當然，對於(yu) 某些抗原性較強的標本，也可采用4%多聚甲醛加0.05%~0.5%的戊二醛固定。有的甚至可以直接采用常規電鏡固定液固定。

2、包埋劑的選擇
    被檢組織采用包埋前或包埋後方法進行免疫染色，應視被標記抗原的情況而定。通常對僅(jin) 檢測細胞表麵的抗原選擇包埋前染色，這樣，不存在脫水、浸透及聚合對細胞抗原的破壞規包埋劑即可。相反，包埋後染色是在標本包埋後才進行免疫染色，對抗原常常造成較大的破壞，因此，應根據待檢抗原的性質選擇合適的包埋劑．以減少對抗原的破壞，提高陽性檢出率。Epon812為(wei) zui常用的電鏡包埋劑，它要求標本在包埋前必須*脫水，一般還需要在60℃聚合，因此，對抗原性往往有較大的破壞。我們(men) 在工作中采用低溫長時間聚合，45℃3天，日的減少聚合反應對抗原性保存的影響。為(wei) 了減少對組織抗原性的破壞，以獲得很強的陽性染色結果，不少實驗室應用低溫包埋劑、透明合成樹脂及水溶性包埋劑（乙二醇甲酯）。通常在鐵蛋白或膠體(ti) 金免疫電鏡技術的包埋後染色中，采用低溫包埋劑。

3、抗血清和探針
     要獲得理想的免疫染色，選擇具有特異性高、親(qin) 和力強的抗血清是實驗成功的首要條件。一般實驗所用的一抗都是通過市場購買(mai) （點擊查看：查找），購置的一抗濃縮液在使用前須用抗體(ti) 稀釋液稀釋，本文認為(wei) 包埋後免疫電鏡染色用的一抗濃度要高於(yu) 光鏡染色的使用濃度10~100倍。有時造成染色失敗的原因之一，就是因為(wei) 把光鏡免疫組化染色的抗體(ti) 作為(wei) 一抗。
探針一般用於(yu) 電鏡下觀察，通常使用膠體(ti) 金顯示。膠體(ti) 金探針既可以通過市場購買(mai) ，也可以按Slot方法自己製備。一般製備的膠體(ti) 金直徑為(wei) 5nm，10nm，15nm幾種規格。

4、特異性吸附問題
    免疫電鏡染色時，通常使用膠體(ti) 金作為(wei) 探針，然而膠體(ti) 金是一種高度敏感的探針，如何克服背景，提高染色結果的特異性便成為(wei) 膠體(ti) 金免疫電鏡檢查的關(guan) 鍵環節。使用效價(jia) 高、特異性強的一抗和活性穩定、濃度適當的免疫金探針以及高質量稀釋度合適的抗體(ti) 是克服背景汙染、獲得理想標記結果的重要條件。隨著稀釋度的增加，汙染蛋白的影響會(hui) 逐漸減弱。一般在檢測某種新的抗原時，須通過方陣滴定來確定一抗及金標的稀釋度。另外，還可以使用高鹽及含去汙劑的緩衝(chong) 液進行洗脫，以減少背景汙染，通常在緩衝(chong) 液中加入氯化鈉及Triton X-100，使其濃度分別為(wei) 2.5%及1%即可。當然一抗和金探針時問的合適，也很重要。一般時間一抗24 h(4℃)，金探針常溫2h。在實驗中，我們(men) 常用正常羊血清(1:50-1:100)或1%牛血清白蛋白作為(wei) 封閉劑，以阻斷非特異性吸附。