5.1. 微生物菌種保藏
在發酵工業(ye) 中，具有良好性狀的菌種的獲得十分不容易，如何利用優(you) 良的微生物菌種保藏技術，使菌種經長期保藏後不但存活健在，而且保證高產(chan) 突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級代謝產(chan) 物和次級代謝產(chan) 物的高產(chan) 能力，即很少發生突變，這對於(yu) 菌種極為(wei) 重要。
微生物菌種保藏技術很多，但原理基本一致，即采用低溫、幹燥、缺氧、缺乏營養(yang) 、添加保護劑或酸度中和劑等方法，挑選優(you) 良純種，是它們(men) 的休眠體(ti) ，使微生物生長在代謝不活潑，生長受抑製的環境中。具體(ti) 常用的方法有：蒸餾水懸浮或斜麵傳(chuan) 代保藏；幹燥-載體(ti) 保藏或冷凍幹燥保藏；超低溫或在液氮中冷凍保藏等方法。

5.1.1. 蒸餾水懸浮法
這是一種zui簡單的菌種保藏方法，隻要將菌種懸浮於(yu) 無菌蒸餾水中，將容器封好口，於(yu) 10℃保藏即可達到目的。好氣性細菌和酵母等可用此法保存。
5.1.2. 斜麵傳(chuan) 代保藏
斜麵傳(chuan) 代保藏方法是將菌種定期在新鮮瓊脂斜麵培養(yang) 基上、液體(ti) 培養(yang) 基中或穿刺培養(yang) ，然後在低溫條件下保存。它可用於(yu) 實驗室中各類微生物的保藏，此法簡單易行，且不要求任何特殊的設備。但此方法易發生培養(yang) 基幹枯、菌體(ti) 自溶、基因突變、菌種退化、菌株汙染等不良現象。因此要求在基本培養(yang) 基上傳(chuan) 代，目的是能淘汰突變株，同時轉接菌量應保持較低水平。斜麵培養(yang) 物應在密閉容器中於(yu) 5℃保藏，以防止培養(yang) 基脫水並降低代謝活性。此方法一般不適宜作工業(ye) 菌種的長期保藏，一般保存時間為(wei) 3~6個(ge) 月。如放線菌於(yu) 4~6℃保存，每3個(ge) 月移接一次；酵母菌於(yu) 4~6℃保存，每4~6個(ge) 月移接一次；黴菌於(yu) 4~6℃保存，每6個(ge) 月移接一次。
5.1.3. 礦物油中浸沒保藏
此方法簡便有效，可用於(yu) 絲(si) 狀真菌、酵母、細菌和放線菌的保藏。特別對難於(yu) 冷凍幹燥的絲(si) 狀真菌和難以在固體(ti) 培養(yang) 基上形成孢子的擔子菌等的保藏更為(wei) 有效。是將瓊脂斜麵或液體(ti) 培養(yang) 物或穿刺培養(yang) 物浸入礦物油中於(yu) 室溫下或冰箱中保藏，操作要點是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yang) 基上生長，然後注入經160℃幹熱滅菌1~2h或濕熱滅菌後120℃烘去水分的礦物油，礦物油的用量以高出培養(yang) 物1cm為(wei) 宜，並以橡皮塞代替棉塞封口，這樣可使菌種保藏時間延長至1~2年。以液體(ti) 石蠟作為(wei) 保藏方法時，應對需保藏的菌株預先作試驗，因為(wei) 某些菌株如酵母、黴菌、細菌等能利用石蠟為(wei) 碳源，還有些菌株對液體(ti) 石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體(ti) 石蠟保藏，為(wei) 了預防不測，一般保藏菌株 2~3年也應做一次存活試驗。
5.1.4. 幹燥-載體(ti) 保藏
此法適用於(yu) 產(chan) 孢子或芽孢的微生物的保藏。是將菌種接種於(yu) 適當的載體(ti) 上，如河砂、土壤、矽膠、濾紙及麩皮等，以保藏菌種。以沙土保藏用得較多，製備方法為(wei) ：將河砂經24目過篩後用10%~20%鹽酸浸泡3~4 h，以除去其中所含的有機物，用水漂洗至中性，烘幹，然後裝入高度約1cm的河沙於(yu) 小試管中，121℃間歇滅菌3次。用無菌吸管將孢子懸液滴入砂粒小管中，經真空幹燥8 h，於(yu) 常溫或低溫下保藏均可，保存期為(wei) 1~10年。土壤法以土壤代替砂粒，不需酸洗，經風幹、粉碎，然後同法過篩、滅菌即可。一般細菌芽孢常用砂管保藏，黴菌的孢子多用麩皮管保藏。
5.1.5. 冷凍保藏
冷凍保藏是指將菌種於(yu) -20℃以下的溫度保藏， 冷凍保藏為(wei) 非常有效的方法。通過冷凍，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為(wei) 了保藏的結果更加令人滿意，通常在培養(yang) 物中加入一定的冷凍保護劑；同時還要認真掌握好冷凍速度和解凍速度。冷凍保藏的缺點是培養(yang) 物運輸較困難。
普通冷凍保藏技術（-20℃）：將菌種培養(yang) 在小的試管或培養(yang) 瓶斜麵上，待生長適度後，將試管或瓶口用橡膠塞嚴(yan) 格封好，於(yu) 冰箱的冷藏室中貯藏，或於(yu) 溫度範圍在-5~20℃的普通冰箱中保存。或者將液體(ti) 培養(yang) 物或從(cong) 瓊脂斜麵培養(yang) 物收獲的細胞分別接到試管或指管內(nei) ，嚴(yan) 格密封後，同上置於(yu) 冰箱中保存。用此方法可以維持若幹微生物的活力 1~2年。應注意的是經過一次解凍的菌株培養(yang) 物不宜再用來保藏。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數微生物的長期保藏。
超低溫冷凍保藏技術：要求長期保藏的微生物菌種，一般都應在-60℃以下的超低溫冷藏櫃中進行保藏。超低溫冷凍保藏的一般方法是：先離心收獲對數生長中期至後期的微生物細胞，再用新鮮培養(yang) 基重新懸浮所收獲的細胞，然後加入等體(ti) 積的20％甘油或10％二甲亞(ya) 碸冷凍保護劑，混勻後分裝入冷凍指管或安瓿中，於(yu) -70℃超低溫冰箱中保藏。超低溫冰箱的冷凍速度一般控製在1~2℃/ min。若幹細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。
液氮冷凍保藏技術：近年來，大量有特殊意義(yi) 和特征的高等動、植物細胞能夠在液氮中長期保藏，並發現在液氮中保藏的菌種的存活率遠比其他保藏方法高且回複突變的發生率極低。液氮保藏巳成為(wei) 工業(ye) 的方法。具體(ti) 方法是：把細胞懸浮於(yu) 一定的分散劑中或是把在瓊脂培養(yang) 基上培養(yang) 好的菌種直接進行液體(ti) 冷凍，然後移至液氮（-196℃）或其蒸汽相中（-l56℃）保藏。進行液氮冷凍保藏時應嚴(yan) 格控製致冷速度。液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟是先製備冷凍保藏菌種的細胞懸液，分裝0.5~1ml入玻璃安瓿或液氮冷藏塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口。然後以1.2℃／min的致冷速度降溫，直到溫度達到相對溫度之上幾度的細胞凍結點（通常為(wei) -30℃）。待細胞凍結後，將致冷速度降為(wei) 1℃／min，直到溫度達到-50℃，將安瓿迅速移入液氮罐中於(yu) 液相（-196℃）或氣相 （-156℃）中保存。如果無控速冷凍機，則一般可用如下方法代替：將安瓿或液氮瓶置於(yu) -70℃冰箱中冷凍4h，然後迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷凍保藏中，zui常用的冷凍保護劑是二甲亞(ya) 碸和甘油，zui終使用濃度一般為(wei) 甘油10％、二甲亞(ya) 碸5％。所使用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞(ya) 碸為(wei) 過濾滅菌。
5.1.6. 真空凍幹保藏
真空冷凍幹燥的基本方法是先將菌種培養(yang) 到zui大穩定期後，一般培養(yang) 放線菌和絲(si) 狀真菌約需7~10天，培養(yang) 細菌約需24~28小時，培養(yang) 酵母約需3天。然後混懸於(yu) 含有保護劑的溶液中，保護劑常選用脫脂乳、蔗糖、動物血清、穀氨酸鈉等，菌液濃度為(wei) 109~1019個(ge) /ml，取0.1~0.2ml菌懸液置於(yu) 安瓿管中冷凍，再於(yu) 減壓條件下使凍結的細胞懸液中的水分升華至1%~5%，使培養(yang) 物幹燥。zui後將管口熔封，保存在常溫下或冰箱中。此法是微生物菌種長期保藏的zui為(wei) 有效的方法之一，大部分微生物菌種可以在凍幹狀態下保藏10年之久而不喪(sang) 失活力。而且經凍幹後的菌株無需進行冷凍保藏，便於(yu) 運輸。但操作過程複雜，並要求一定的設備條件。
5.1.7. 寄主保藏
適用於(yu) 一些難於(yu) 用常規方法保藏的動植物病原菌和病毒。
5.1.8. 基因工程菌的保藏
隨著基因工程的不斷發展，越來越多的基因工程菌需要得到合理的保藏，由於(yu) 它們(men) 的載體(ti) 質粒等所攜帶的外源DNA片段的遺傳(chuan) 性狀不太穩定、且其外源質粒複製子很容易丟(diu) 失。另外，對於(yu) 宿主細胞質粒基因通常為(wei) 生長非必需，一般情況下當細胞丟(diu) 失這些質粒時，生長速度會(hui) 加快。而由質粒編碼的抗生素抗性在富集含此類質粒的細胞群體(ti) 時極為(wei) 有用。當培養(yang) 基中加入抗生素時，抗生素提供了一有利於(yu) 攜帶質粒的細胞群體(ti) 的極有用的生長選擇壓。而且在運用基因工程菌進行發酵時，抗生素的加入可幫助維持質粒複製與(yu) 染色體(ti) 複製的協調。由此看來基因工程菌應保藏在含低濃度選擇劑的培養(yang) 基中。例如，質粒pBR322。它除了能將外源DNA 輸入E．coli細胞外，還賦予E．coli細胞Ampr和Tetr。如果在培養(yang) 基中加入Amp和Tet，則培養(yang) 時可選擇出含pBR322質粒的細胞。